정상적인 인간 체세포는 일정한 양의 DNA를 포함하는 이배체입니다. 세포 주기가 진행되는 동안 DNA 합성으로 전체 DNA 함량이 두 배로 늘어나고 유사 분열 후 정상적인 DNA 함량을 회복합니다. NovoCyte 유세포 분석기를 사용하면 상세한 세포 주기 분석을 수행하여 종양 세포 분화, 세포 변형 및 세포 화합물 간의 상호 작용을 이해할 수 있습니다.
그림: 10µg/M MG132 또는 500µg/M 5-FI로 16시간 처리한 후, ACEA NovoCyte 유세포 분석기로 A549 세포의 세포 주기 분포를 분석했습니다. NovoExpress에 포함된 세포 주기 분석 모듈을 사용하면 플롯에 G0/G1 단계(녹색), S 단계(노란색) 및 G2/M 단계(파란색)의 세포가 표시됩니다. 일반 미처리 세포와 비교하여 MG132 처리 세포는 G2/M 단계에서 정지된 반면 5-FU 처리 세포는 G0/G1 단계에서 정지되었습니다.
Detection and analysis of intracellular proteins allow for additional characterization of cell subpopulations and cellular processes. In order to analyze proteins not located on the cell surface, fixation and permeabilization of the cell is required. However, many phospho-specific antibodies are not compatible with many common detergent-based permeabilization methods used for intracellular staining. Special attention is needed when determining the proper fix/perm method for your phospho-specific antibody. The most common method uses 1.5% paraformaldehyde for fixation followed by 100% methanol for permeabilization. While this method works for many antibodies, please note it may not work for every phospho-specific antibody.
Additionally, identifying various cell populations in a heterogenous sample requires staining for phosphorylated proteins coupled with surface proteins. Special consideration must be given to the sensitivity of these epitopes to fixative, taking precaution to avoid damage to the epitope. Therefore, the sample may require staining for specific surface markers before fixation.
Flow cytometry has traditionally been used to detect extracellular proteins to identify different cell populations. With the advancement of technology and reagents in recent years, we now are able to easily detect intracellular proteins in individual cells. One very useful application for the detection of intracellular proteins is to measure specific cells signaling pathways. These pathways are often altered in disease states, such as cancer, and are now easily detected using flow cytometry providing single cell analysis of these signaling changes.
Jurkat cells were either left in culture(pERK unstim) or stimulated with cell stimulation cocktail for 1hr (pERK +stim). Cells were washed, fixed and permeablized, followed by staining with anti-phospo-ERK1/2 (T204/Y202) PerCP antibody for 1hr. Cells were washed and analyzed on the NovoCyte flow cytometer for phospho-ERK levels and compared using a histogram overlay generated with the NovoExpress acquisition and analysis software.
NovoCyte Penteon Flow Cytometer
사이토카인은 병원체, 자가면역 또는 치료제에 의한 활성화에 대한 면역세포 반응에 필수적인 저분자입니다. 사이토카인에 의한 신호 전달은 유전자 조절, 선천성 면역과 적응성 면역 반응, 그리고 염증을 조절할 수 있습니다. 사이토카인 폭풍 증후군은 사이토카인 및 관련 분자가 억제되지 않은 채로 과잉 생성되어 발생하는 생명을 위협하는 염증 반응인데, 치료법, 암 및 COVID-19를 포함한 다양한 병원체에 의해 면역계가 과도하게 반응하여 나타납니다. 따라서 사이토카인 생성을 측정하고 사이토카인 생성의 근원을 확인하는 것은 면역 반응에 대한 심층적인 이해에 중요합니다. 사이토카인의 비드 기반 유세포 분석 기반 검출은 형광 강도가 다양한 비드 집단의 혼합물을 사용하여 단일 시료에서 여러 용해성 분석물을 측정하는 데 매우 효과적인 방법입니다. 사이토카인, 케모카인, 성장 인자 및 인산화된 세포 신호전달 단백질을 포함한 분비 및 세포내 단백질의 정량적 측정은 기초 연구에서 광범위하게 응용됩니다.
Agilent NovoCyte Advanteon 유세포 분석기는 과학자들의 까다로운 필요를 충족시킬 수 있을 뿐만 아니라 초보 사용자도 쉽게 이용할 수 있도록 설계되었습니다. 다음과 같은 기능을 제공하는 유세포 분석기 라인을 통해 사이토카인 분비를 쉽게 정량할 수 있습니다:
정확한 절대 세포 수로 다양한 흐름 속도에서 재현 가능한 결과를 얻을 수 있으므로 참조 비드가 불필요
다른 실험실 자동화 플랫폼에 통합되어 FACS 튜브(40 튜브 랙 사용)와 24-, 48-, 96- 및 384-well 플레이트를 높은 처리량으로 처리
작은 입자를 감지할 수 있는 높은 감도와 뛰어난 산란 분해능
간편한 유지보수 및 자동 세척 주기를 특징으로 하는 직관적인 기기 운용과 소프트웨어
최대 5개의 레이저를 사용하고 최대 30개의 형광 채널을 선택할 수 있는 유연성
NovoCyte 유세포 분석기는 신뢰할 수 있는 Agilent 품질로 제작되었으며 신뢰할 수 있는 성능을 제공하는 검증된 이력을 보유하고 있습니다. 고급 유체 설계 기능은 귀하가 필요로 하는 재현성을 제공하는 동시에 예약 및 자동 시작 및 종료, 자동 세척 주기, 배치 분석 및 보고 기능을 제공합니다. 빠르고 견고한 자동 시료 주입기를 사용하여 실험실을 떠난 후에도 유세포 분석기가 작업을 수행하고 시료를 수집하도록 합니다. 수동 유지보수 또는 검출기 설정을 정기적으로 조정해야 하는 번거로움을 해소합니다.
Agilent NovoCyte Penteon 유세포 분석기용으로 설계된 유세포 분석 패널을 사용하여 세포가 세 가지 주요 사이토카인인 IL-2, IFNγ 및 TNFα를 생성하는 빈도를 결정하고, 표면 마커로 PBMC의 주요 세포 군집인 단핵구, T 세포, NK 세포, B 세포를 식별할 수 있었습니다. 림프구 및 단핵구 군집은 사이드 스캐터(SSC)을 기반으로 게이팅되었고, CD45 및 림프구 군집의 발현은 각각 B 림프구와 T 림프구를 식별하는 CD19 및 CD3의 발현에 의해 추가로 구별되었습니다.
αCD3 항체 활성화는 T 세포 수용체(TCR) 경로를 특이적으로 표적화하여 T 세포를 신속하게 활성화합니다. 이 연구에서는 사이토카인 생성과 활성화를 빠르게 분석하기 위해 초기 단계 T 세포 활성화가 세포내 염색에 의해 쉽게 측정되는지 확인하는 데 목표를 두었습니다. 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 αCD3(오른쪽) 또는 IgG(왼쪽) 및 대조 코팅된 미세역가 플레이트(1μg/mL)에서 15시간 동안 활성화한 후 항체 염색을 수행했습니다. CD3+ T 세포를 게이팅한 다음 IFN-y 생성을 평가했습니다.
BioLegend LEGENDplex COVID-19 사이토카인 폭풍 패널 1 및 2, Agilent NovoCyte Penteon 유세포 분석기 및 LEGENDplex 분석 소프트웨어를 사용하여 사이토카인 생성을 정량했습니다. 이 분석을 통해 하나의 웰에서 최대 14개의 사이토카인을 동시에 평가할 수 있어 시료와 시간을 절약할 수 있습니다. 분리된 PBMC를 LPS(1ng/mL) PBS 대조군 또는 αCD3/IgG 대조군 코팅 미세역가 플레이트(1μg/mL)로 자극했습니다. 여기에서는 αCD3 자극에서 IgG 대조군(회색), LPS에서 PBS 대조군(녹색)으로 분비 농도의 배수 변화를 비교했습니다.