Proliferation Assays by Flow Cytometry

유세포 분석법은 단일 시료에서 서로 다른 세포 유형을 식별할 수 있는 능력으로 개별 세포의 증식을 측정하는 데 이상적입니다. 세포 증식의 정량 분석은 세포 성장과 분화에 대한 연구에 매우 중요하며, 신약 개발 중 화합물 독성과 종양 세포 성장 억제를 평가하는 데 사용됩니다. T 세포 증식에 대한 세대별 분석은 또한 세포 치료의 발전에 매우 중요합니다.

미토콘드리아 효소(MTT), 아데노신 삼인산(ATP), 세포 주기 관련 단백질 발현(Ki-67), 뉴클레오티드 아날로그(BrdU), 세포 추적 염료(CFSE) 측정을 포함하여 많은 검사가 세포 증식 측정에 사용됩니다. 이러한 검사의 대부분은 대량의 집단 분석을 제공하지만 개별 또는 혼합된 세포 집단을 측정하지는 않습니다.

이와 대조적으로, 유세포 분석법은 세포 증식, 생존력, 세포 주기, 개별 세포 또는 혼합 집단의 세포 사멸과 같은 세포 현상의 다중 파라미터 분석에 사용될 수 있습니다. Agilent NovoCyte 유세포 분석기가 어떻게 증식 분석을 간편하게 수행하는지 알아보세요.

• 작은 입자까지 검출 가능한 고품질 산란 분리능

• 다양한 유속에서 일관된 결과 제공

• 정확한 절대 세포 수가 지원되므로 참조 비드 불필요

• 간편한 유지보수, 자동 세척 주기

A Powerful Yet Affordable Flow Cytometer for Proliferation Assays

NovoCyte 유세포 분석기는 신뢰할 수 있는 Agilent 품질로 제작되었으며 신뢰할 수 있는 성능을 제공하는 검증된 이력을 보유하고 있습니다. 수동 유지보수 또는 검출기 설정을 정기적으로 조정해야 하는 번거로움을 해소합니다. 고급 유체 설계 기능은 귀하가 필요로 하는 재현성을 제공하는 동시에 예약 및 자동 시작 및 종료, 자동 세척 주기, 배치 분석 및 보고 기능을 제공합니다. 빠르고 견고한 자동 시료 주입기를 사용하여 실험실을 떠난 후에도 유세포 분석기가 작업을 수행하고 시료를 수집하도록 합니다.

Generational Analysis of T cell Proliferation Using Cell-Tracking Dyes

Primary T 세포에서 세포 분열을 구별하는 다른 세포 추적 염료의 능력을 시험하기 위해, PBMC에 ViaFluor488, CFSE 또는 CellTrace Violet이 라벨링 되었고, 그 후 anti-CD3 항체로 활성화하였습니다. 각 시료에서 CD4 및 CD8 T 세포의 증식을 분석하기 위해, NovoExpress 소프트웨어의 세포 증식 모듈을 사용하여 집단에 나타나는 피크/분열 수를 측정했습니다. 모든 시료에서 CD8 T 세포 집단의 증식이 CD4 집단보다 높았습니다.

Using Flow Cytometry to Measure Effects of anti-CD3 Antibody on T cell Proliferation

코팅 anti-CD3 항체는 0에서 1µg/mL로 적정하여 세포 증식을 유도하는 데 이상적인 농도를 측정하였습니다. 예상대로 anti-CD3 항체의 양이 증가하면서 T 세포의 증식이 증가하였으나, 1µg/mL의 항-CD3 항체를 이용한 경우 0.25µg/mL과 비교하여 분열 피크의 분리능을 개선하였습니다. 세포와 분열 지수를 나누는 빈도는 CD3의 모든 농도에서 CD4 및 CD8 집단에서 동일했지만, 증식 지수는 CD8 T 세포 집단에서 더 높았습니다.

Cell Cycle Analysis by Flow Cytometry in Response to Various Treatments

세포 분열을 조절하는 분자 메커니즘을 연구하는 것은 암과 같은 생리학적, 병태 생리학적 현상에 대한 이해의 핵심입니다. 특정 세포 주기 단계를 분석하기 위해 T 세포를 G1 및 G2/M에서 성장을 억제하는 것으로 알려진 화합물로 처리하였습니다. 5-fluorouracil (5-FU) 치료는 세포 주기의 G1 단계에 축적되는 세포 집단을 52.22%에서 70.07%로 증가시켰습니다. 반면 Paclitaxel 치료는 G2/M 단계 세포의 비율을 13.86%에서 66.58%로 증가시켰습니다.

Measuring Proliferation and Cell Division Using CFSE

CFSE 라벨의 세포가 분열한 경우, 염료가 딸세포 사이에 균등하게 분할되며, 염료가 지속적으로 희석되기 때문에 시간이 경과함에 따라 CFSE 형광 손실을 측정할 수 있습니다. 본 예시에서 Jurkat T 세포는 CFSE로 라벨링 되었고 24시간마다 CFSE 형광 측정을 얻습니다. 세포 증식은 CFSE 염료의 연속 희석으로 이어지며, 이는 특정 수의 세포 분열을 거친 모집단을 감지할 수 있게 합니다.

Immunophenotyping by Flow Cytometry

면역 상태는 질병 상태, 치료 효율성 및 백신과 같은 외부 자극에 대한 반응과 관련이 있습니다. 면역 표현형 분석으로 후보 세포 유형, 하위 등급 및 기능을 신속하게 식별할 수 있습니다. 면역 세포는 백신의 면역원성과 그 효율성에 영향을 미칠 수 있으므로 다양한 면역 세포 집단의 빈도와 단핵구, NK 세포, T와 B 세포 같은 특정 세포 하위 집합의 분화 및 활성화 상태를 모니터링하는 것이 필수적입니다. NovoCyte 유세포 분석기는 여러 백혈구를 동시에 정량할 수 있어 환자의 면역 상태를 보다 잘 이해하고 전염성 질환에 대한 면역 반응을 감시할 수 있습니다.

Flow cytometry is a powerful tool for analyzing highly heterogeneous cells, such as immune cells in blood, to identify cell populations of interest. During the adaptive immune response, T cells are activated to rapidly divide and destroy infected or cancerous cells The detection of T cell inhibitory receptors has become a focus of cancer immunotherapy research, since reversing inhibitory receptor expression through checkpoint inhibitor blockade has been shown to restore T cell function and improve tumor immunity. However, the analysis of T cell inhibitory receptor expression alone does not provide a complete view of T cell state. Measuring additional markers for T cell differentiation, activation, previous antigen exposure, degranulation, and cytokine production provides a more comprehensive understanding.

While significant advances in flow cytometry instrumentation and reagents have made complex multicolor immunophenotyping experiments easier to perform, the variety of markers that can be analyzed can be limited to the number of available fluorescent channels on the instrument. Additionally, high-performance flow cytometers often require an extensive amount of experience to deliver high-quality results.

Agilent NovoCyte Flow Cytometers are designed to meet the needs of the most demanding scientists while still being accessible to novice users. Easily generate comprehensive immunophenotyping data with a line of flow cytometers that provides:

• Reproducible results at varying flow rates with accurate absolute cell counts, rendering reference beads unnecessary

• Integration into different laboratory automation platforms for high-throughput processing of FACS tubes (using a 40-tube rack) and 24-, 48-, 96-, and 384-well plates

• High sensitivity and excellent scatter resolution to detect small particles

• Intuitive instrument operation and powerful software, with easy maintenance and automatic cleaning cycles

• Flexibility to choose from up to 30 fluorescence channels, utilizing up to 5 lasers

A Powerful Yet Affordable Flow Cytometer for Immunophenotyping

NovoCyte

유세포 분석기는 신뢰할 수 있는 Agilent 품질로 제작되었으며 신뢰할 수 있는 성능을 제공하는 검증된 이력을 보유하고 있습니다. 고급 유체 설계 기능은 귀하가 필요로 하는 재현성을 제공하는 동시에 예약 및 자동 시작 및 종료, 자동 세척 주기, 배치 분석 및 보고 기능을 제공합니다. 빠르고 견고한 자동 시료 주입기를 사용하여 실험실을 떠난 후에도 유세포 분석기가 작업을 수행하고 시료를 수집하도록 합니다. 수동 유지보수 또는 검출기 설정을 정기적으로 조정해야 하는 번거로움을 해소합니다.

Identification of immune cells in peripheral human blood

이 24색 유세포 분석기 패널에서, 면역 세포는 표면 수용체의 발현에 의해 규명됩니다. 과립구 및 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 SSC 및 CD45 발현에 의해 식별됩니다. 과립구 하위 집합은 CD16이 호중구(CD16+) 또는 호산구(CD16-)로 발현함으로써 구분됩니다. PBMC 모집단에서 CD14 발현은 단핵 세포(CD14+SSChi)에서 림프구(CD14-SSClo)를 식별하는 데 사용됩니다. 림프구 집단은 추가로 분리됩니다.

In-Depth Analysis of T Cell State by Flow Cytometry

T 세포 분화 및 활성화에 대한 자세한 정보를 얻고, 유세포 분석법으로 TCR 활성화에 대한 T 세포의 반응을 측정하세요. 이 예시에서는 항CD3, 항CD28 항체, interleukin-2(IL-2)로 자극된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 분석하여 PerCP-Cy5.5 및 BV570 형광 색소를 사용하여 CD4 및 CD8 T 세포의 빈도를 측정합니다. T 세포 분화는 또한 NovoCyte 유세포 분석으로 CD45RA 및 CCR7의 표면 발현을 기반으로 T 세포 subset의 상대적 빈도를 측정합니다.

Determine Inhibitory Receptor Expression for Specific T Cell Subsets

T 세포의 억제 수용체 및 활성화 마커 발현 수준의 측정은 T 세포 효과 기능의 면역 치료 효과 연구에 필수적입니다. 또한, T 세포 탈진의 정도는 다양한 억제 수용체의 동시 발현과 깊은 상관관계가 있습니다. NovoCyte 유세포 분석기를 사용하여 단일 워크플로에서 CD25, CD127의 발현, PD-1, LAG-3, TIM-3의 탈진, IL-2, TNF-α, IFN-α의 사이토카인 분비, CD4+, CD8+ T 세포 하위 집합 내의 CD107α의 탈과립화 수준을 쉽게 측정할 수 있습니다.

Measure Inhibitory and Activation Receptors over Time

With persistent stimulation, inhibitory receptor expression increases and is a key indicator of T cell  exhaustion. Defining how inhibitory receptors are upregulated during acute and persistent T cell stimulation is essential for the development of safer and more effective therapeutic manipulations of these pathways. In this example, the NovoCyte flow cytometer is used to examine activation markers (CD25 and CD127) and inhibitory receptors (PD-1, LAG3, and TIM-3) on days zero, two, and four and after restimulation on day five.

Apoptosis Assays by Flow Cytometry

유세포 분석법은 서로 다른 단계에서 세포 사멸 또는 세포 죽음을 겪고 있는 세포의 집단을 측정하기 위한 유연한 다용도 분석법입니다. 세포 사멸 초기에 미토콘드리아는 세포막 전위를 상실하고 제 기능을 하지 못하여 cytochromeC 방출과 caspases의 활성화를 야기합니다. 유세포 분석법은 caspases3 및 7에 따라 특별한 절단 부위가 있는 프로브 분자를 사용하여 세포에서 활성화된 caspases의 감지를 가능하게 합니다. 초기 사멸 세포에서 이러한 활성화된 caspases에 의해 절단될 때, 프로브 분자는 핵으로 들어가 DNA와 결합하고 형광을 나타냅니다.

세포 사멸의 초기 단계에는 또한 내세포막에서 외층으로 phosphatidylserine(PS) 전이가 수반되어 세포외 환경에 노출됩니다. 세포막은 세포 사멸의 후기 단계에서 투과성을 띠며, 그 무결성과 선택적 물질 운반을 저해합니다. Annexin V와 같은 유세포 분석 시약은 초기 사멸 세포의 라벨링을 위해 세포막에 노출된 PS를 결합하는 데 사용될 수 있고, DNA 결합 염료 7-AAD는 세포의 라벨링에 사용될 수 있습니다.

고성능 유세포 분석기는 종종 고품질의 결과를 전달하기 위해 교육 또는 광범위한 경험을 필요로 합니다. Agilent NovoCyte 유세포 분석기는 초보자도 쉽게 접근할 수 있도록 설계되어 있어 가장 까다로운 과학자의 요구를 충족시킬 수 있습니다. 다음을 제공하는 유세포 분석기 라인에 대해 알아보세요.

• 작은 입자까지 검출 가능한 고품질 산란 분리능

• 다양한 유속에서 일관된 결과 제공

• 정확한 절대 세포 수가 지원되므로 참조 비드 불필요

• 간편한 유지보수, 자동 세척 주기

A Powerful Yet Affordable Flow Cytometer for Apoptosis Assays

NovoCyte 유세포 분석기는 신뢰할 수 있는 Agilent 품질로 제작되었으며 신뢰할 수 있는 성능을 제공하는 검증된 이력을 보유하고 있습니다. 수동 유지보수 또는 검출기 설정을 정기적으로 조정해야 하는 번거로움을 해소합니다. 고급 유체 설계 기능은 귀하가 필요로 하는 재현성을 제공하는 동시에 예약 및 자동 시작 및 종료, 자동 세척 주기, 배치 분석 및 보고 기능을 제공합니다. 빠르고 견고한 자동 시료 주입기를 사용하여 실험실을 떠난 후에도 유세포 분석기가 작업을 수행하고 시료를 수집하도록 합니다.

Detect Early and Late Apoptotic Cells using Annexin V and 7-AAD by Flow Cytometry

이러한 세포 사멸 분석은 staurosporine은 Jurkat T 세포와 HeLa 세포 모두에서 세포 사멸을 유도한다는 것을 보여주며, 세포 사멸의 초기 및 장기 단계에 대한 통찰력을 제공합니다. Staurosporine 처리 후 4시간 동안 아넥신 V-FITC 및 DNA 결합 염료 7-AAD를 사용한 phosphatidylserine을 통해 초기 및 후기 사멸 세포를 분석하였습니다. 세포는 Annexin V에서 양성 염색 시 초기 세포 사멸, Annexin-V 및 7-AAD 양성 염색에서는 후기 세포 사멸(또는 죽음)로 분류되었습니다.

Measure Mitochondrial Membrane Potential Loss in Early Apoptotic Cells

Jurkat T 세포는 이러한 유세포 분석 세포 사멸 분석에서 staurosporine으로 처리되며, 이어서 형광 염료 JC-1을 첨가합니다. JC-1은 세포 투과성이며 막 전위가 유지되는 동안 미토콘드리아 내부에 응집되어 PE 채널에서 형광을 방출합니다. 막 전위가 상실되면 JC-1은 미토콘드리아로 국소화되지 않고 단량체 형태로 세포질에 상주하며 FITC 채널에서 형광을 방출합니다. PE 대 FITC 형광 비율은 미토콘드리아 막 전위의 변화를 나타냅니다.

Using Flow Cytometry to Quantify Caspase 3 and 7

Activity in Early Apoptotic Cells

이러한 세포 사멸 분석에서는 staurosporine 처리된 Jurkat T 세포가 처리되지 않은 대조군 세포보다 더 많은 카스파제 활성을 보인다는 것을 보여줍니다. Jurkat T 세포는 1시간 또는 4시간 이내에 2µM의 staurosporine으로 처리되었고, 세포 투과성, DEVD-결합형 형광 핵산 결합 염료 및 7-AAD 염료로 염색되었습니다. 처리되지 않은 대조군 세포는 최소한의 카스파제 활성을 보이는 반면, staurosporine으로 처리된 세포는 Caspase3 및 7 활성(99.7%)이 유의미하게 증가하였습니다.